RNA抽出

2011年4月13日 (水)

実験ノート②アラビの種子からRNA抽出

お題;  (;д;) アラビの種子に「ベタベタした粘性物」&「茶色の夾雑物」が含まれて
          RNA抽出が難・し・い!

⇒リーゾの「RNAすいすい-P」&塩化リチウム&(株)チヨダサイエンスの
「FARBカラム」で解決( ̄ー ̄)ニヤリ

ちなみに定法で抽出したRNAはこんな感じ→Rnarna

                      粘性物(半透明の沈殿)もこんなにある→Rna

1. 氷上に乳鉢・乳棒を置き冷却しておきます①。
2. 乳鉢に600 μℓのRNAすいすい-Pと24μℓの2-メルカプトエタノールをいれ、種子20 mgとともに乳棒で破砕します。
3. エッペンチューブに上記すべてをピペットで移し、酸性フェノール500 μℓ、クロロホルム200 μℓ入れ、よく混合した後、氷上で10 分間静置します。
4. 15,000 rpm×10分間、4℃で遠心分離を行います。
5. 上清450μℓに150μℓの10M LiCl(上清の1/3量)を入れ、よく混合した後、氷中に30分間静置します。
6. 15,000 rpm×10分間、4℃で遠心分離を行います。
7. 上清を捨て②、沈殿にRNAすいすい-Pを400μℓ入れ、沈殿を溶解します。
8. さらに400μℓの99.5% EtOHを入れよく混合した後、全量をチヨダサイエンスの「トータルRNA抽出用カラム」にアプライします。
9. 10,000 rpm×10秒間、室温で遠心分離を行います。
10. 廃液を捨て、750μℓの70%EtOHをアプライします。
11. 10,000 rpm×10秒間、室温で遠心分離を行います。→カラム上でのDNaseI処理をする場合は下記へ
12. 廃液を捨て、750μℓの70%EtOHをアプライします。
13. 15,000 rpm×10秒間、室温で遠心分離を行います。
14. 新しい1.5 mlのチューブにカラムを移します。
15. 50μℓの水をメンブレン上にアプライし、室温で5分間静置します。
16. 15,000 rpm×10秒間、室温で遠心分離を行います。
17. 溶出画分にRNAが含まれます。

①今回の実験では乳鉢を使用しました。MM-300など利用したビーズによるサンプル破砕でも可能だと思います。
②上清がなるべく残らないように捨てて下さい。ピペットで丁寧に吸い上げるのがベスト。

♪:;;;:♪:;;;:♪DNaseI処理♪:;;;:♪:;;;:♪:;;;:♪:;;;:♪:;;;:♪:;;;:♪:;;;:♪:;;;:♪:;;;:♪:;;;:♪

操作「11.」の後に、0.5U/ulのDNaseIを50 ulカラムにアプライ
→15 min 室温でインキュベーション
→300 ulの70% エタノールをアプライ、3 min静置
→10,000 rpm、20秒間遠心分離
→廃液を捨て、700 μlの70%EtOHをFARBカラムにアプライ
→10,000 rpm、60秒間遠心分離
→操作「14.」へ。

*操作「17.」の後にDNaseI処理する方法ももちろんOK。

<実験結果>

①↓電気泳動の結果です(DNaseI処理なし)。定法(右側)だと粘性物が取り除けず、泳動がすごく乱れているのがわかります。一方、上記プロトコルで抽出したRNAはきれいな泳動像が確認できました。LiCl処理で粘性物が取り除けました。溶出したRNA溶液は無色透明でした。

Rna_3

②↓分光光度計で濃度を測定した結果です。260nm/280nm比は1.95でした。約20 mgの種子より6.9μgのRNAが得られました。(DNaseI処理なし)

Rna_4

RNAすいすい-Pはこちら

リーゾへ

2011年4月 1日 (金)

実験ノート①RNA画分が茶色で困った!

お題;  (;д;) せっかく抽出したRNA画分に茶色色素が残って困った!

⇒リーゾの「RNAすいすい-P」&(株)チヨダサイエンスの「FARBカラム」で解決 ( ̄▽ ̄)

(実験例)

ある雑草種子から定法でRNAを抽出すると最終的に得たRNA画分に茶色の色素が残ってしまう、とのご相談を受けRNAすいすい-P(株)チヨダサイエンスのFARBカラム(Total RNA用)を使って検討してみました。

プロトコール

1. 氷上に乳鉢①を置き、RNAすいすい-P 1,000μlと2-メルカプトエタノール40μlを入れ準備しておきます。
2. 分析試料(60 mg程度)を乳棒で破砕し、氷上で5分静置します。
3. 500μl②をチューブに入れ、水飽和フェノール500μl、クロロホルム200μlを加えてよく混合し、氷上で5分静置します。
4. 15,000 rpm、10分間、4℃で遠心分離を行います。
5. 上清400 μlに、400μlのEtOH(終濃度50%)を加え、よく混合します。
6. 上記全量をFARBカラムにアプライします。
7. 10,000 rpm、20秒間遠心分離を行います。
8. 廃液③を捨て、700 μlの70%EtOHをFARBカラムにアプライします。
9. 10,000 rpm、20秒間遠心分離を行います。
10. 廃液を捨て、700 μlの70%EtOHをFARBカラムにアプライします。
11. 10,000 rpm、60秒間遠心分離を行います。④
12. 新しい1.5 mlチューブにFARBカラムをセットし、水50 μl (RNase free)をカラム内のメンブレン上にアプライし、5分間静置します。
13. 15,000 rpm、20秒間遠心分離を行います。(試料によっては12, 13の操作をもう一度行うとRNAの収量が上がる場合があります⑤。)
14. 溶出液=RNA (注意;DNAも含まれます)

①弊社にある機器の都合上、乳鉢を使用いたしました。MM-300などチューブ内でビーズと共に破砕する機器をお持ちの場合は、種子30 mg/500μl; RNAすいすい-P+2-ME; 20 μl の容量比で抽出を行うといいのではないでしょうか。

②乳鉢を使用して試料を破砕すると、回収時に種皮がピペットチップの先に詰まり、すべてを回収するのが困難なため、今回は、抽出液の一部を以降に使用。

③廃液に色素成分(茶色)が認められました。

④DNAをカラムメンブレン上で除去する為には、操作「11.」の後に、0.5U/ulのDNaseIを50 ulカラムにアプライ→15 min 室温でインキュベーション→300 ulの70% エタノールをアプライ、3 min静置→10,000 rpm、20秒間遠心分離→廃液を捨て、700 μlの70%EtOHをFARBカラムにアプライ→10,000 rpm、60秒間遠心分離→操作「12.」へ。*操作「14.」の後にDNaseI処理する方法ももちろんOK。

⑤検討に使用した試料において、工程「12」および「13」をもう一度繰り返してみたところ、溶出画分にはRNAが含まれていたので(全RNAの1割程度。9割は1回目の溶出で回収された)、場合によっては、この工程を合計2回行うことをお勧めします。

<電気泳動写真>

 Rna_2

 <濃度測定>

Rna_4

・RNA画分の溶液は無色透明でした。

FARBC-C50(50個入、\9,000), Total RNA用は(株)チヨダサイエンス様が販売しています。

リーゾへはこちらhttp://www.rizo.co.jp/

その他のカテゴリー