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2011年4月 1日 (金)

実験ノート①RNA画分が茶色で困った!

お題;  (;д;) せっかく抽出したRNA画分に茶色色素が残って困った!

⇒リーゾの「RNAすいすい-P」&(株)チヨダサイエンスの「FARBカラム」で解決 ( ̄▽ ̄)

(実験例)

ある雑草種子から定法でRNAを抽出すると最終的に得たRNA画分に茶色の色素が残ってしまう、とのご相談を受けRNAすいすい-P(株)チヨダサイエンスのFARBカラム(Total RNA用)を使って検討してみました。

プロトコール

1. 氷上に乳鉢①を置き、RNAすいすい-P 1,000μlと2-メルカプトエタノール40μlを入れ準備しておきます。
2. 分析試料(60 mg程度)を乳棒で破砕し、氷上で5分静置します。
3. 500μl②をチューブに入れ、水飽和フェノール500μl、クロロホルム200μlを加えてよく混合し、氷上で5分静置します。
4. 15,000 rpm、10分間、4℃で遠心分離を行います。
5. 上清400 μlに、400μlのEtOH(終濃度50%)を加え、よく混合します。
6. 上記全量をFARBカラムにアプライします。
7. 10,000 rpm、20秒間遠心分離を行います。
8. 廃液③を捨て、700 μlの70%EtOHをFARBカラムにアプライします。
9. 10,000 rpm、20秒間遠心分離を行います。
10. 廃液を捨て、700 μlの70%EtOHをFARBカラムにアプライします。
11. 10,000 rpm、60秒間遠心分離を行います。④
12. 新しい1.5 mlチューブにFARBカラムをセットし、水50 μl (RNase free)をカラム内のメンブレン上にアプライし、5分間静置します。
13. 15,000 rpm、20秒間遠心分離を行います。(試料によっては12, 13の操作をもう一度行うとRNAの収量が上がる場合があります⑤。)
14. 溶出液=RNA (注意;DNAも含まれます)

①弊社にある機器の都合上、乳鉢を使用いたしました。MM-300などチューブ内でビーズと共に破砕する機器をお持ちの場合は、種子30 mg/500μl; RNAすいすい-P+2-ME; 20 μl の容量比で抽出を行うといいのではないでしょうか。

②乳鉢を使用して試料を破砕すると、回収時に種皮がピペットチップの先に詰まり、すべてを回収するのが困難なため、今回は、抽出液の一部を以降に使用。

③廃液に色素成分(茶色)が認められました。

④DNAをカラムメンブレン上で除去する為には、操作「11.」の後に、0.5U/ulのDNaseIを50 ulカラムにアプライ→15 min 室温でインキュベーション→300 ulの70% エタノールをアプライ、3 min静置→10,000 rpm、20秒間遠心分離→廃液を捨て、700 μlの70%EtOHをFARBカラムにアプライ→10,000 rpm、60秒間遠心分離→操作「12.」へ。*操作「14.」の後にDNaseI処理する方法ももちろんOK。

⑤検討に使用した試料において、工程「12」および「13」をもう一度繰り返してみたところ、溶出画分にはRNAが含まれていたので(全RNAの1割程度。9割は1回目の溶出で回収された)、場合によっては、この工程を合計2回行うことをお勧めします。

<電気泳動写真>

 Rna_2

 <濃度測定>

Rna_4

・RNA画分の溶液は無色透明でした。

FARBC-C50(50個入、\9,000), Total RNA用は(株)チヨダサイエンス様が販売しています。

リーゾへはこちらhttp://www.rizo.co.jp/

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