« 実験ノート①RNA画分が茶色で困った! | トップページ | 実験ノート③イナワラからDNA抽出はできるの!? »

2011年4月13日 (水)

実験ノート②アラビの種子からRNA抽出

お題;  (;д;) アラビの種子に「ベタベタした粘性物」&「茶色の夾雑物」が含まれて
          RNA抽出が難・し・い!

⇒リーゾの「RNAすいすい-P」&塩化リチウム&(株)チヨダサイエンスの
「FARBカラム」で解決( ̄ー ̄)ニヤリ

ちなみに定法で抽出したRNAはこんな感じ→Rnarna

                      粘性物(半透明の沈殿)もこんなにある→Rna

1. 氷上に乳鉢・乳棒を置き冷却しておきます①。
2. 乳鉢に600 μℓのRNAすいすい-Pと24μℓの2-メルカプトエタノールをいれ、種子20 mgとともに乳棒で破砕します。
3. エッペンチューブに上記すべてをピペットで移し、酸性フェノール500 μℓ、クロロホルム200 μℓ入れ、よく混合した後、氷上で10 分間静置します。
4. 15,000 rpm×10分間、4℃で遠心分離を行います。
5. 上清450μℓに150μℓの10M LiCl(上清の1/3量)を入れ、よく混合した後、氷中に30分間静置します。
6. 15,000 rpm×10分間、4℃で遠心分離を行います。
7. 上清を捨て②、沈殿にRNAすいすい-Pを400μℓ入れ、沈殿を溶解します。
8. さらに400μℓの99.5% EtOHを入れよく混合した後、全量をチヨダサイエンスの「トータルRNA抽出用カラム」にアプライします。
9. 10,000 rpm×10秒間、室温で遠心分離を行います。
10. 廃液を捨て、750μℓの70%EtOHをアプライします。
11. 10,000 rpm×10秒間、室温で遠心分離を行います。→カラム上でのDNaseI処理をする場合は下記へ
12. 廃液を捨て、750μℓの70%EtOHをアプライします。
13. 15,000 rpm×10秒間、室温で遠心分離を行います。
14. 新しい1.5 mlのチューブにカラムを移します。
15. 50μℓの水をメンブレン上にアプライし、室温で5分間静置します。
16. 15,000 rpm×10秒間、室温で遠心分離を行います。
17. 溶出画分にRNAが含まれます。

①今回の実験では乳鉢を使用しました。MM-300など利用したビーズによるサンプル破砕でも可能だと思います。
②上清がなるべく残らないように捨てて下さい。ピペットで丁寧に吸い上げるのがベスト。

♪:;;;:♪:;;;:♪DNaseI処理♪:;;;:♪:;;;:♪:;;;:♪:;;;:♪:;;;:♪:;;;:♪:;;;:♪:;;;:♪:;;;:♪:;;;:♪

操作「11.」の後に、0.5U/ulのDNaseIを50 ulカラムにアプライ
→15 min 室温でインキュベーション
→300 ulの70% エタノールをアプライ、3 min静置
→10,000 rpm、20秒間遠心分離
→廃液を捨て、700 μlの70%EtOHをFARBカラムにアプライ
→10,000 rpm、60秒間遠心分離
→操作「14.」へ。

*操作「17.」の後にDNaseI処理する方法ももちろんOK。

<実験結果>

①↓電気泳動の結果です(DNaseI処理なし)。定法(右側)だと粘性物が取り除けず、泳動がすごく乱れているのがわかります。一方、上記プロトコルで抽出したRNAはきれいな泳動像が確認できました。LiCl処理で粘性物が取り除けました。溶出したRNA溶液は無色透明でした。

Rna_3

②↓分光光度計で濃度を測定した結果です。260nm/280nm比は1.95でした。約20 mgの種子より6.9μgのRNAが得られました。(DNaseI処理なし)

Rna_4

RNAすいすい-Pはこちら

リーゾへ

« 実験ノート①RNA画分が茶色で困った! | トップページ | 実験ノート③イナワラからDNA抽出はできるの!? »

RNA抽出」カテゴリの記事

コメント

この記事へのコメントは終了しました。

トラックバック

この記事のトラックバックURL:
http://app.f.cocolog-nifty.com/t/trackback/1489125/39448008

この記事へのトラックバック一覧です: 実験ノート②アラビの種子からRNA抽出:

« 実験ノート①RNA画分が茶色で困った! | トップページ | 実験ノート③イナワラからDNA抽出はできるの!? »