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2011年4月

2011年4月28日 (木)

すにっぷすいすいの活用術② 導入遺伝子と内在遺伝子の発現解析

今回ご紹介する利用法は、以外な利用法です。 Σ( ゜Д゜)ハッ!

その②類似した遺伝子配列を持つ導入遺伝子/内在性遺伝子 の発現解析

例えば、遺伝子組み換え体などで導入した遺伝子が内在性遺伝子に類似していて(次の図)、それぞれについての発現解析をしてみたい場合にすにっぷすいすいはとても便利です。内在性の遺伝子同士で配列が酷似しているような場合にもOKです。
Photo_2
上記のような場合、リアルタイムPCRによる発現解析では通常のプライマー設計をしてしまうと、導入遺伝子だけを増幅させたいのに、遺伝子配列が酷似しているがゆえに内在性遺伝子までもが増幅してしまう、 そんな困った問題がありました。

そこで、すにっぷすいすいの出番です。
上記の例では赤枠で囲んだいずれかの遺伝子配列の違いを利用してプライマー設計を行います。もちPhoto_3ろん、その設計でPCR反応がうまくいくかどうか(特異的に増幅するかどうか)や、最適なPCR条件の検討も詳細に行ってから、プライマーセットをお客様に納品いたします(左の図、検討・確認のイメージ)。

そして、このプライマーセットを使用すれば、組み換え体の内在性遺伝子、導入遺伝子の発現解析が可能になります(下図)。Photo_4

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2011年4月22日 (金)

すにっぷすいすいの活用術① PAGEによる断片長比較を簡便化

リーゾの受託サービスに「すいにっぷすいすい」があるのですが、SNPs解析に関連のあるご研究者の皆様だけでなく、意外と広い範囲の研究ツールとして使えるので、その具体例を紹介させていただきます。

今まで面倒だった実験が簡便化してすいすいと研究が進む便利ツールです。是非、ご活用ください!

その① 「PAGEによる断片長比較」 ⇒ 「PCRによる増幅あり・なし」で判定

例えば、ある遺伝子について品種Aに2塩基の欠損があり、欠損のない品種Bと判別したいケース

⇒今までは、、、
PCRで目的遺伝子を増幅後、2塩基のDNA断片長の違いをPAGEで解析することにより、品種AとBを判別していた(下の図)。

Page PAGEはゲル作成がちょっと面倒、そして2塩基分の泳動度の差を「じぃーっと」目を凝らして判定するのは、疲れちゃう。一度に解析できる検体数もそんなに多くない、などの短所があります。

Page_4これを、「すにっぷすいすい」を使ってみると、、、☟ ☟ ☟ ☟ ☟

品種AおよびBのそれぞれに対する検出用プライマーセットでPCR後、アガロースゲルで電気泳動。増幅がある・なし を判別するだけです。目を凝らしてわずかな違いを判定しなくてよく、ストレスがありません。アガロースゲルならゲル作製も簡便、泳動時間も15分程度で済みますし、ゲル作製の型によって一度に96サンプル分解析することも可。また、リーゾ商品の5×PCRすいすいを使えばゲル染色不要なので、電気泳動後すぐにUV照射下で結果を知ることができます。

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2011年4月15日 (金)

実験ノート③イナワラからDNA抽出はできるの!?

お題;  (`Д´) イナワラ(乾燥した組織)からDNA抽出ってできるの?

⇒リーゾの「DNAすいすい-W」で解決  (*^ー゚)bグッジョブ!!

今回は”乾燥した組織;イナワラ”から乳鉢など使用せずに簡単でラクにDNAを抽出する方法を紹介します。PCRを目的としたDNA抽出法なので、「とにかく大量にDNAを取りたいっ」という場合には向いていませんのでご注意ください。

゜。°。°。°。°。°プロトコール。°。°。゜。°。°。°。

1. イナワラ10 mgをハサミで2-3 mmの大きさに切り刻み、1.5 mlチューブへ入れる。
Photo_7
←こんな感じ

2. DNAすいすい-Wを360 μℓと抽出補助剤40 μℓを上記チューブへいれる(さらにキット内に付属の添加剤を40 µl加えてもOK)。
3. 1,000 μℓ用チップの先をライターで炙り、先端の穴が閉じたもの(簡易ペッスル)を使用して1.5 mlチューブ内で試料を破砕する。(チューブ内で簡易ペッスルをグリグリと回しながら押しつける感じ)

Photo_6 4. さらに、バッファー360 μℓと添加剤40 μℓを上記チューブへいれ、混合する。
5. 65℃で15分インキュベーション。(15分間の間に1-2度、エッペンチューブを上下に転倒混和するとよい)
6. インキュベーターからサンプルを取り出し、室温に5分間静置。(←直後にフェノール・クロロホルムを添加し、混合するとエッペンチューブから液体が漏れることがあるので、安全性のため冷却します)
7. フェノール・クロロホルム(1:1)を500 μℓを加え、よく混合する。
8. 15,000 rpm×10分間、遠心分離を行う。
9. 上清500 μℓを新しい1.5 mlエッペンチューブに移し取り、等量のイソプロパノールを加えて混合
10. 15,000 rpm×10分間、遠心分離を行う。
11. 上清を捨て、1,000 μℓの70% EtOHで沈殿を洗浄する。
12. 15,000 rpm×10分間、遠心分離を行う。
13. 上清を捨て、清潔なパーパータオル上でチューブを逆さまにして立てておき、風乾する。(乾燥させすぎるとDNAが水に溶けにくくなるので注意する)

Dna 14. 30 μℓの水に溶解する

゜。°。°。°。°。°結果。°。°。゜。°。°。°。

<分光光度計によるDNA濃度測定>

Dna_2

微量測定用のセルがないのですが、なんとか頑張って測定してみました。

<アガロースゲル電気泳動によるDNAチェック(1% agarose)>

↓DNA 15μℓを泳動
Dna_5 ←高分子のDNAから分解されかかった低分子のDNAまで見えてます(ワラなのでインタクトのDNAはとれません)。

<イナワラから抽出したDNAを使用したPCR実験>

・3種類の増幅産物の長さが異なるプライマーセット(500 bp, 400 bp, 214 bp)を使用してPCRを行いました。
・各プライマーセットそれぞれについてDNA濃度を50 ng, 25ng, 12.5 ng, 6.25 ng/15μℓ PCR反応系あたり に変化させてPCRを行いました。
Pcr

↑いずれのプライマーセットにおいても、DNA濃度においても目的遺伝子の増幅が認められました。

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2011年4月13日 (水)

実験ノート②アラビの種子からRNA抽出

お題;  (;д;) アラビの種子に「ベタベタした粘性物」&「茶色の夾雑物」が含まれて
          RNA抽出が難・し・い!

⇒リーゾの「RNAすいすい-P」&塩化リチウム&(株)チヨダサイエンスの
「FARBカラム」で解決( ̄ー ̄)ニヤリ

ちなみに定法で抽出したRNAはこんな感じ→Rnarna

                      粘性物(半透明の沈殿)もこんなにある→Rna

1. 氷上に乳鉢・乳棒を置き冷却しておきます①。
2. 乳鉢に600 μℓのRNAすいすい-Pと24μℓの2-メルカプトエタノールをいれ、種子20 mgとともに乳棒で破砕します。
3. エッペンチューブに上記すべてをピペットで移し、酸性フェノール500 μℓ、クロロホルム200 μℓ入れ、よく混合した後、氷上で10 分間静置します。
4. 15,000 rpm×10分間、4℃で遠心分離を行います。
5. 上清450μℓに150μℓの10M LiCl(上清の1/3量)を入れ、よく混合した後、氷中に30分間静置します。
6. 15,000 rpm×10分間、4℃で遠心分離を行います。
7. 上清を捨て②、沈殿にRNAすいすい-Pを400μℓ入れ、沈殿を溶解します。
8. さらに400μℓの99.5% EtOHを入れよく混合した後、全量をチヨダサイエンスの「トータルRNA抽出用カラム」にアプライします。
9. 10,000 rpm×10秒間、室温で遠心分離を行います。
10. 廃液を捨て、750μℓの70%EtOHをアプライします。
11. 10,000 rpm×10秒間、室温で遠心分離を行います。→カラム上でのDNaseI処理をする場合は下記へ
12. 廃液を捨て、750μℓの70%EtOHをアプライします。
13. 15,000 rpm×10秒間、室温で遠心分離を行います。
14. 新しい1.5 mlのチューブにカラムを移します。
15. 50μℓの水をメンブレン上にアプライし、室温で5分間静置します。
16. 15,000 rpm×10秒間、室温で遠心分離を行います。
17. 溶出画分にRNAが含まれます。

①今回の実験では乳鉢を使用しました。MM-300など利用したビーズによるサンプル破砕でも可能だと思います。
②上清がなるべく残らないように捨てて下さい。ピペットで丁寧に吸い上げるのがベスト。

♪:;;;:♪:;;;:♪DNaseI処理♪:;;;:♪:;;;:♪:;;;:♪:;;;:♪:;;;:♪:;;;:♪:;;;:♪:;;;:♪:;;;:♪:;;;:♪

操作「11.」の後に、0.5U/ulのDNaseIを50 ulカラムにアプライ
→15 min 室温でインキュベーション
→300 ulの70% エタノールをアプライ、3 min静置
→10,000 rpm、20秒間遠心分離
→廃液を捨て、700 μlの70%EtOHをFARBカラムにアプライ
→10,000 rpm、60秒間遠心分離
→操作「14.」へ。

*操作「17.」の後にDNaseI処理する方法ももちろんOK。

<実験結果>

①↓電気泳動の結果です(DNaseI処理なし)。定法(右側)だと粘性物が取り除けず、泳動がすごく乱れているのがわかります。一方、上記プロトコルで抽出したRNAはきれいな泳動像が確認できました。LiCl処理で粘性物が取り除けました。溶出したRNA溶液は無色透明でした。

Rna_3

②↓分光光度計で濃度を測定した結果です。260nm/280nm比は1.95でした。約20 mgの種子より6.9μgのRNAが得られました。(DNaseI処理なし)

Rna_4

RNAすいすい-Pはこちら

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2011年4月 1日 (金)

実験ノート①RNA画分が茶色で困った!

お題;  (;д;) せっかく抽出したRNA画分に茶色色素が残って困った!

⇒リーゾの「RNAすいすい-P」&(株)チヨダサイエンスの「FARBカラム」で解決 ( ̄▽ ̄)

(実験例)

ある雑草種子から定法でRNAを抽出すると最終的に得たRNA画分に茶色の色素が残ってしまう、とのご相談を受けRNAすいすい-P(株)チヨダサイエンスのFARBカラム(Total RNA用)を使って検討してみました。

プロトコール

1. 氷上に乳鉢①を置き、RNAすいすい-P 1,000μlと2-メルカプトエタノール40μlを入れ準備しておきます。
2. 分析試料(60 mg程度)を乳棒で破砕し、氷上で5分静置します。
3. 500μl②をチューブに入れ、水飽和フェノール500μl、クロロホルム200μlを加えてよく混合し、氷上で5分静置します。
4. 15,000 rpm、10分間、4℃で遠心分離を行います。
5. 上清400 μlに、400μlのEtOH(終濃度50%)を加え、よく混合します。
6. 上記全量をFARBカラムにアプライします。
7. 10,000 rpm、20秒間遠心分離を行います。
8. 廃液③を捨て、700 μlの70%EtOHをFARBカラムにアプライします。
9. 10,000 rpm、20秒間遠心分離を行います。
10. 廃液を捨て、700 μlの70%EtOHをFARBカラムにアプライします。
11. 10,000 rpm、60秒間遠心分離を行います。④
12. 新しい1.5 mlチューブにFARBカラムをセットし、水50 μl (RNase free)をカラム内のメンブレン上にアプライし、5分間静置します。
13. 15,000 rpm、20秒間遠心分離を行います。(試料によっては12, 13の操作をもう一度行うとRNAの収量が上がる場合があります⑤。)
14. 溶出液=RNA (注意;DNAも含まれます)

①弊社にある機器の都合上、乳鉢を使用いたしました。MM-300などチューブ内でビーズと共に破砕する機器をお持ちの場合は、種子30 mg/500μl; RNAすいすい-P+2-ME; 20 μl の容量比で抽出を行うといいのではないでしょうか。

②乳鉢を使用して試料を破砕すると、回収時に種皮がピペットチップの先に詰まり、すべてを回収するのが困難なため、今回は、抽出液の一部を以降に使用。

③廃液に色素成分(茶色)が認められました。

④DNAをカラムメンブレン上で除去する為には、操作「11.」の後に、0.5U/ulのDNaseIを50 ulカラムにアプライ→15 min 室温でインキュベーション→300 ulの70% エタノールをアプライ、3 min静置→10,000 rpm、20秒間遠心分離→廃液を捨て、700 μlの70%EtOHをFARBカラムにアプライ→10,000 rpm、60秒間遠心分離→操作「12.」へ。*操作「14.」の後にDNaseI処理する方法ももちろんOK。

⑤検討に使用した試料において、工程「12」および「13」をもう一度繰り返してみたところ、溶出画分にはRNAが含まれていたので(全RNAの1割程度。9割は1回目の溶出で回収された)、場合によっては、この工程を合計2回行うことをお勧めします。

<電気泳動写真>

 Rna_2

 <濃度測定>

Rna_4

・RNA画分の溶液は無色透明でした。

FARBC-C50(50個入、\9,000), Total RNA用は(株)チヨダサイエンス様が販売しています。

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